Huile essentielle pure de Saposhnikovia divaricata pour la fabrication de bougies et de savons, diffuseur en gros, nouvelle huile essentielle pour diffuseurs à roseaux

brève description:

 

2.1. Préparation du SDE

Les rhizomes de SD ont été achetés sous forme d'herbe séchée auprès de Hanherb Co. (Guri, Corée). La taxonomie du matériel végétal a été confirmée par le Dr Go-Ya Choi de l'Institut coréen de médecine orientale (KIOM). Un spécimen de référence (numéro 2014 SDE-6) a été déposé dans l'Herbier coréen des ressources végétales standard. Les rhizomes séchés de SD (320 g) ont été extraits deux fois avec de l'éthanol à 70 % (avec un reflux de 2 h), puis concentrés sous pression réduite. La décoction a été filtrée, lyophilisée et conservée à 4 °C. Le rendement en extrait sec à partir des matières premières brutes était de 48,13 % (p/p).

 

2.2. Analyse quantitative par chromatographie liquide à haute performance (HPLC)

L'analyse chromatographique a été réalisée à l'aide d'un système HPLC (Waters Co., Milford, MA, États-Unis) et d'un détecteur à barrette de photodiodes. Pour l'analyse HPLC du SDE, le prim-O- l'étalon de glucosylcimifugine a été acheté auprès de l'Institut coréen de promotion de l'industrie de la médecine traditionnelle (Gyeongsan, Corée), etsec-O-glucosylhamaudol et 4′-O-β-D-glucosyl-5-O-méthylvisamminol ont été isolés dans notre laboratoire et identifiés par des analyses spectrales, principalement par RMN et MS.

Des échantillons de SDE (0,1 mg) ont été dissous dans de l'éthanol à 70 % (10 ml). La séparation chromatographique a été réalisée avec une colonne XSelect HSS T3 C18 (4,6 × 250 mm, 5μm, Waters Co., Milford, MA, États-Unis). La phase mobile était composée d'acétonitrile (A) et d'acide acétique à 0,1 % dans l'eau (B) à un débit de 1,0 mL/min. Un programme de gradient à plusieurs étapes a été utilisé comme suit : 5 % A (0 min), 5–20 % A (0–10 min), 20 % A (10–23 min) et 20–65 % A (23–40 min). La longueur d'onde de détection a été balayée à 210–400 nm et enregistrée à 254 nm. Le volume d'injection était de 10,0μL. Des solutions standard pour la détermination de trois chromones ont été préparées à une concentration finale de 7,781 mg/mL (prim-O-glucosylcimifugine), 31,125 mg/mL (4′-O-β-D-glucosyl-5-O-méthylvisamminol) et 31,125 mg/mL (sec-O-glucosylhamaudol) dans du méthanol et conservé à 4°C.

2.3. Évaluation de l'activité anti-inflammatoireIn vitro

2.3.1. Culture cellulaire et traitement des échantillons

Les cellules RAW 264.7 ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, États-Unis) et cultivées dans un milieu DMEM contenant 1 % d'antibiotiques et 5,5 % de FBS. Les cellules ont été incubées dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2 à 37 °C. Pour stimuler les cellules, le milieu a été remplacé par du milieu DMEM frais et du lipopolysaccharide (LPS, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, États-Unis) à 1μg/mL a été ajouté en présence ou en l'absence de SDE (200 ou 400μg/mL) pendant 24 h supplémentaires.

2.3.2. Détermination de l'oxyde nitrique (NO), de la prostaglandine E2 (PGE2) et du facteur de nécrose tumoraleα(TNF-α) et la production d'interleukine-6 ​​(IL-6)

Les cellules ont été traitées avec du SDE et stimulées avec du LPS pendant 24 h. La production de NO a été analysée en mesurant les nitrites à l'aide du réactif de Griess, conformément à une étude précédente [12]. Sécrétion des cytokines inflammatoires PGE2, TNF-α, et l'IL-6 a été dosée à l'aide d'un kit ELISA (systèmes R&D) conformément aux instructions du fabricant. Les effets du SDE sur la production de NO et de cytokines ont été déterminés à 540 nm ou 450 nm à l'aide d'un Wallac EnVision.™lecteur de microplaques (PerkinElmer).

2.4. Évaluation de l'activité antiarthrosiqueIn vivo

2.4.1. Animaux

Des rats mâles Sprague-Dawley (âgés de 7 semaines) ont été achetés auprès de Samtako Inc. (Osan, Corée) et hébergés dans des conditions contrôlées avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures à°C et% d'humidité. Les rats ont reçu une alimentation et de l'eau de laboratoiread libitumToutes les procédures expérimentales ont été réalisées conformément aux directives des National Institutes of Health (NIH) et approuvées par le Comité de protection et d'utilisation des animaux de l'université de Daejeon (Daejeon, République de Corée).

2.4.2. Induction de l'arthrose par MIA chez le rat

Les animaux ont été randomisés et assignés à des groupes de traitement avant le début de l'étude (par groupe). Solution MIA (3 mg/50μUne solution saline à 0,9 % a été injectée directement dans l'espace intra-articulaire du genou droit sous anesthésie induite par un mélange de kétamine et de xylazine. Les rats ont été répartis aléatoirement en quatre groupes : (1) le groupe salin sans injection de MIA ; (2) le groupe MIA avec injection de MIA ; (3) le groupe traité par SDE (200 mg/kg) avec injection de MIA ; et (4) le groupe traité par indométacine (IM) (2 mg/kg) avec injection de MIA. Les rats ont reçu du SDE et de l'IM par voie orale une semaine avant l'injection de MIA pendant quatre semaines. La posologie de SDE et de l'IM utilisée dans cette étude était basée sur celle utilisée dans des études précédentes.10,13,14].

2.4.3. Mesures de la répartition du poids des pattes arrière

Après l'induction de l'OA, l'équilibre initial de la capacité de charge des pattes arrière a été perturbé. Un testeur d'incapacitance (Linton Instrumentation, Norfolk, Royaume-Uni) a été utilisé pour évaluer les variations de la tolérance à la charge. Les rats ont été soigneusement placés dans la chambre de mesure. La force de charge exercée par le membre postérieur a été moyennée sur une période de 3 s. Le rapport de répartition du poids a été calculé par l'équation suivante : [poids du membre postérieur droit/(poids du membre postérieur droit + poids du membre postérieur gauche)] × 100 [15].

2.4.4. Mesures des taux de cytokines sériques

Les échantillons sanguins ont été centrifugés à 1 500 g pendant 10 minutes à 4 °C ; le sérum a ensuite été prélevé et conservé à −70 °C jusqu’à son utilisation. Les taux d’IL-1β, IL-6, TNF-α, et PGE2 dans le sérum ont été mesurés à l'aide de kits ELISA de R&D Systems (Minneapolis, MN, États-Unis) conformément aux instructions du fabricant.

2.4.5. Analyse RT-PCR quantitative en temps réel

L'ARN total a été extrait du tissu articulaire du genou à l'aide du réactif TRI® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis), rétrotranscrit en ADNc et amplifié par PCR à l'aide d'un kit TM One Step RT PCR avec SYBR green (Applied Biosystems, Grand Island, NY, États-Unis). La PCR quantitative en temps réel a été réalisée à l'aide du système Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems, Grand Island, NY, États-Unis). Les séquences d'amorces et de sondes sont présentées dans le tableau.1Des aliquotes d'ADNc d'échantillon et une quantité égale d'ADNc de GAPDH ont été amplifiées avec le mélange maître TaqMan® Universal PCR contenant de l'ADN polymérase, conformément aux instructions du fabricant (Applied Biosystems, Foster, CA, États-Unis). Les conditions de PCR étaient de 2 min à 50 °C, 10 min à 94 °C, 15 s à 95 °C et 1 min à 60 °C pendant 40 cycles. La concentration du gène cible a été déterminée par la méthode comparative Ct (nombre de cycles seuil au point de croisement entre le tracé d'amplification et le seuil), conformément aux instructions du fabricant.

Prix ​​FOB :0,5 à 9 999 $ US / pièce

Quantité minimum de commande :100 pièces/pièces

Capacité d'approvisionnement :10 000 pièces par mois