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brève description :

 

2.1. Préparation du SDE

Les rhizomes de SD ont été achetés sous forme d'herbe séchée auprès de Hanherb Co. (Guri, Corée). Les matières végétales ont été confirmées taxonomiquement par le Dr Go-Ya Choi de l'Institut coréen de médecine orientale (KIOM). Un spécimen de référence (numéro 2014 SDE-6) a été déposé à l'Herbier coréen des ressources végétales standard. Les rhizomes séchés de SD (320 g) ont été extraits deux fois avec de l'éthanol à 70 % (avec un reflux de 2 h) et l'extrait a ensuite été concentré sous pression réduite. La décoction a été filtrée, lyophilisée et conservée à 4°C. Le rendement en extrait séché à partir des matières premières brutes était de 48,13 % (p/p).

 

2.2. Analyse quantitative par chromatographie liquide haute performance (HPLC)

L'analyse chromatographique a été réalisée avec un système HPLC (Waters Co., Milford, MA, USA) et un détecteur à réseau de photodiodes. Pour l'analyse HPLC du SDE, le prim-O-l'étalon de glucosylcimifugine a été acheté auprès du Korea Promotion Institute for Traditional Medicine Industry (Gyeongsan, Corée), etsec-O-glucosylhamaudol et 4′-O-β-D-glucosyl-5-O-méthylvisamminol ont été isolés au sein de notre laboratoire et identifiés par analyses spectrales, principalement par RMN et MS.

Des échantillons de SDE (0,1 mg) ont été dissous dans de l'éthanol à 70 % (10 ml). La séparation chromatographique a été réalisée avec une colonne XSelect HSS T3 C18 (4,6 × 250 mm, 5μm, Waters Co., Milford, MA, États-Unis). La phase mobile était constituée d'acétonitrile (A) et de 0,1 % d'acide acétique dans de l'eau (B) à un débit de 1,0 mL/min. Un programme de gradient en plusieurs étapes a été utilisé comme suit : 5 % A (0 min), 5 à 20 % A (0 à 10 min), 20 % A (10 à 23 min) et 20 à 65 % A (23 à 40 min). ). La longueur d'onde de détection a été balayée entre 210 et 400 nm et enregistrée à 254 nm. Le volume d'injection était de 10,0μL. Des solutions étalons pour la détermination de trois chromones ont été préparées à une concentration finale de 7,781 mg/mL (prim-O-glucosylcimifugine), 31,125 mg/mL (4′-O-β-D-glucosyl-5-O-méthylvisamminol), et 31,125 mg/mL (sec-O-glucosylhamaudol) dans du méthanol et conservé à 4°C.

2.3. Évaluation de l'activité anti-inflammatoireIn vitro

2.3.1. Culture cellulaire et traitement des échantillons

Les cellules RAW 264.7 ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) et cultivées dans un milieu DMEM contenant 1% d'antibiotiques et 5,5% de FBS. Les cellules ont été incubées dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 à 37°C. Pour stimuler les cellules, le milieu a été remplacé par du milieu DMEM frais et du lipopolysaccharide (LPS, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA) à 1μg/mL a été ajouté en présence ou en absence de SDE (200 ou 400μg/mL) pendant 24 h supplémentaires.

2.3.2. Détermination de l'oxyde nitrique (NO), de la prostaglandine E2 (PGE2), du facteur de nécrose tumorale-α(TNF-α) et la production d'interleukine-6 ​​(IL-6)

Les cellules ont été traitées avec du SDE et stimulées avec du LPS pendant 24 h. La production de NO a été analysée en mesurant les nitrites à l'aide du réactif de Griess selon une étude précédente [12]. Sécrétion des cytokines inflammatoires PGE2, TNF-α, et l'IL-6 a été déterminée à l'aide d'un kit ELISA (systèmes R&D) conformément aux instructions du fabricant. Les effets du SDE sur la production de NO et de cytokines ont été déterminés à 540 nm ou 450 nm à l'aide d'un Wallac EnVision™lecteur de microplaques (PerkinElmer).

2.4. Évaluation de l'activité anti-arthroseEn Vivo

2.4.1. Animaux

Des rats mâles Sprague-Dawley (âgés de 7 semaines) ont été achetés auprès de Samtako Inc. (Osan, Corée) et hébergés dans des conditions contrôlées avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures à°C et% humidité. Les rats ont reçu une alimentation de laboratoire et de l'eauà volonté. Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées conformément aux directives des National Institutes of Health (NIH) et approuvées par le Comité de protection et d'utilisation des animaux de l'université de Daejeon (Daejeon, République de Corée).

2.4.2. Induction de l'arthrose avec MIA chez le rat

Les animaux ont été randomisés et répartis dans des groupes de traitement avant le début de l'étude (par groupe). Solution MIA (3 mg/50μL de solution saline à 0,9%) a été directement injectée dans l'espace intra-articulaire du genou droit sous anesthésie induite par un mélange de kétamine et de xylazine. Les rats ont été divisés au hasard en quatre groupes : (1) le groupe salin sans injection de MIA, (2) le groupe MIA avec injection de MIA, (3) le groupe traité au SDE (200 mg/kg) avec injection de MIA et (4 ) le groupe traité à l'indométacine (IM-) (2 mg/kg) avec injection de MIA. Les rats ont reçu une administration orale de SDE et IM 1 semaine avant l'injection de MIA pendant 4 semaines. Les doses de SDE et IM utilisées dans cette étude étaient basées sur celles utilisées dans les études précédentes.10,13,14].

2.4.3. Mesures de la répartition du poids des pattes postérieures

Après l’induction de l’arthrose, l’équilibre initial de la capacité de charge des pattes postérieures a été perturbé. Un testeur d'incapacité (Linton instrumentation, Norfolk, Royaume-Uni) a été utilisé pour évaluer les changements dans la tolérance de mise en charge. Les rats ont été soigneusement placés dans la chambre de mesure. La force d'appui exercée par le membre postérieur a été moyennée sur une période de 3 s. Le rapport de répartition du poids a été calculé par l'équation suivante : [poids sur le membre postérieur droit/(poids sur le membre postérieur droit + poids sur le membre postérieur gauche)] × 100 [15].

2.4.4. Mesures des niveaux de cytokines sériques

Les échantillons de sang ont été centrifugés à 1 500 g pendant 10 min à 4°C ; Ensuite, le sérum a été collecté et conservé à -70 ° C jusqu'à utilisation. Les niveaux d'IL-1β, IL-6, TNF-αet la PGE2 dans le sérum ont été mesurées à l'aide de kits ELISA de R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) conformément aux instructions du fabricant.

2.4.5. Analyse RT-PCR quantitative en temps réel

L'ARN total a été extrait du tissu de l'articulation du genou à l'aide du réactif TRI® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), transcrit de manière inverse en ADNc et amplifié par PCR à l'aide d'un kit TM One Step RT PCR avec SYBR green (Applied Biosystems , Grand Island, New York, États-Unis). La PCR quantitative en temps réel a été réalisée à l'aide du système de PCR en temps réel Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems, Grand Island, NY, USA). Les séquences d'amorces et la séquence de sonde sont présentées dans le tableau1. Des aliquotes d'ADNc d'échantillon et une quantité égale d'ADNc de GAPDH ont été amplifiées avec le mélange maître TaqMan® Universal PCR contenant de l'ADN polymérase conformément aux instructions du fabricant (Applied Biosystems, Foster, CA, USA). Les conditions de PCR étaient de 2 min à 50°C, 10 min à 94°C, 15 s à 95°C et 1 min à 60°C pendant 40 cycles. La concentration du gène cible a été déterminée à l'aide de la méthode comparative Ct (numéro de cycle seuil au point de croisement entre le tracé d'amplification et le seuil), conformément aux instructions du fabricant.

Prix ​​FOB :0,5 à 9 999 $ US / pièce

Quantité minimum de commande :100 pièces/pièces

Capacité d'approvisionnement :10000 pièces/pièces par mois